产品解析第14期：SEEKER，新生儿LSD筛查系统

发表时间：2024-06-04 09:48

新生儿筛查(Newborn Screening, NBS)被广泛认为是美国公共卫生项目最成功的典范之一，它确保了所有婴儿在出生时针对某些严重的疾病进行一次筛查。2017年2月，Baebies公司针对新生儿罕见溶酶体贮积症（Lysosomal Storage Disorders, LSDs）开发的SEEKER系统获批上市，该系统可用于4种新生儿罕见代谢疾病的筛查，包括检测粘多糖病（Mucopolysaccharidosis）类型I （MPS I）、庞贝氏症（Pompe）、高雪氏症（Gaucher）和法布里病（Fabry）。该项目是首个被美国食品和药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）授权的用于检测溶酶体贮积病的新生儿筛查平台。相对于传统的多重串联质谱法、微孔板荧光法等，基于自动化的数字微流控平台（Digital microfluidics, DMF）开发出来的SEEKER系统具有高通量、快速响应的特点：在由4 台分析仪组合的单个工作站上，3小时内可处理多达 706 个干血斑(Dried Blood Spot, DBS)样品，并进行5种LSDs的筛查。接下来，小编将带大家一起来了解这款产品的芯片结构和流体工作原理。

图1 LSDs筛查工作站

注：溶酶体贮积症（LSD）是一组遗传性代谢疾病，是由于基因突变致溶酶体中有关酸性水解酶缺陷，导致机体中相应的生物大分子不能正常降解而在溶酶体中贮积，引起细胞组织器官功能的障碍。溶酶体贮积症不是一种单一的疾病，而是包括50种酶缺陷组成的一组疾病。如果没有及时被检测到并进行治疗，这些遗传性疾病可能导致器官损伤、神经学残疾甚至死亡。通过新生儿筛查LSD，可以及时进行治疗干预，从而有效降低LSD的发病率和死亡率。

检测原理：以粘多糖病类型I（MPS I）的检测为例，MPS I是由于编码α-L-艾杜糖苷酶（a-L-iduronidase，IDUA）的基因变异，导致机体IDUA酶活性缺乏或降低，从而使体内黏多糖（又称糖胺聚糖，glycosaminoglycan，GAG）不能完全降解而贮积在细胞溶酶体。利用4-甲基伞形酮（4-MU）荧光定量法。4-MU酯类在裂解之后能产生荧光，以4-MU-α-IDU（4-methylumbelliferyl α-l-iduronide）为底物与患者干血斑提取物进行孵育，通过测定反应液中4-MU的荧光值来判定患者血样中的IDUA酶活，从而进一步判定患者是否患有MPS I。

【产品简介】

Oxford Nanopore Sequencing第三代测序系统的主要特点：

【芯片解析】

图3 基于电润湿的数字微流体原理

电润湿(Electrowetting-on-Dielectric)是指通过调整施加在液体-固体电极之间的电势，来改变液体和固体之间的表面张力，从而改变两者之间的接触角。

视频液滴操控功能

数字微流控平台可以在开板或双板“三明治”形式的芯片上操作，图3概述了基于电润湿的 DMF 适用于双板形式的原理。DMF芯片的下底板为带有分立电极PCB材料，PCB 材料表面涂有介电和疏水材料；顶板由透明塑料制成，内表面涂有导电和疏水涂层。上下板形成一种三明治结构，为防止水滴蒸发，在上下板之间装满油相流体。通过向电极施加电压，可以从储液池中分离出样品液滴，分离出的液滴通过电润湿原理被吸引到活化的电极上，并通过向其施加电压同时关闭先前激活的电极上的电压而将液滴移动到相邻的电极。因此液滴可以使用由计算机程序控制的电脉冲沿着PCB上电极图案定义的路径移动。

图4 符合标准微量滴定板尺寸的数字微流控DMF卡盒的示意图

如图4所示，该DMF卡盒由带电极阵列的底板、样品孔、储液槽、废液槽、荧光检测窗口以及塑料上盖组成。每个DMF卡盒上有 48 个样品孔（储液槽 1-12，A-D 行），其中包括4-MU校准品、干血斑提取缓冲液和质量控制（Quality Control, QC）点提取物；5 个试剂储液槽（R1–R5）；5 个终止缓冲液储液槽（S1–S5）和一个废液槽，用于在孵育和检测后收集所有液滴。从这些储液槽中一次分配的液滴体积为 100 nL。所有液滴操作均通过软件程序自动进行，该软件程序可根据需要执行液滴的分配、运输、混合、孵育和处理。内置荧光计读取检测窗口处的荧光。

卡盒上LSDs筛选流程：

①安装：在上样之前，将DMF卡盒插入台式分析仪的甲板中。该分析仪包含执行微流体操作所需的所有电气元件、一个可以编程到所需温度的加热台(用于酶促反应)，以及能够在 370 nm激发波长和 460 nm发射波长下检测 4-MU的荧光计。

②上样：使用多通道移液器将干血斑样品（1.6μl）的提取物转移到数字微流控卡盒（图4）上的样品输入孔中。将制备的试剂、校准品和终止缓冲液平衡至环境温度，各自取12μl并转移到数字微流控卡盒上的对应储液槽中。样品与试剂加样完毕后的操作均由软件自动控制，无需人工操作。

③校准：在化验开始之前，需要在每个试剂盒上绘制重复的4点4-MU校准曲线。从图4中标记为 A1、B1、C1 和 D1 的每个校准储液槽中，分配3个单位大小的液滴（每个单位大小的液滴约100 nL）合并形成一个三倍大小的液滴（约 300 nL）。重复该过程，从每个校准储液槽获得2个三倍尺寸的液滴，总共得到8个三倍尺寸的校准液滴。这些液滴被引导到检测窗口（图4）进行荧光测量。使用线性回归构建重复的 4 点校准曲线。该校准曲线用于将原始荧光值转换为 4-MU 的摩尔数以反应酶活性。

④反应：从第一个试剂储液槽（R1，图 4）分配出 44 个单位大小的液滴，并输送到样品储存器的网格中，在那里单位大小的试剂液滴与单位大小的样品液滴合并，形成 44 个反应混合物液滴。在其余 4 个试剂储存器（R2-R5，图 4）中重复这一过程，总共形成 220 个反应混合物液滴。反应混合物液滴在 37 °C 下孵育 1 小时。

⑤淬灭：孵育结束后，从终止缓冲液储液槽（S1-S5，图 4）中分出单位大小的液滴，与反应混合物液滴按顺序合并，以终止酶促反应。

⑥测量：液滴被输送至荧光检测窗口，由内置荧光计测量荧光值，每个荧光计大约需6秒的读数时间，完成读数后根据校准曲线计算出酶活并输出报告。随后液滴被输送到废液槽。

视频数字微流控芯片上的模拟多重酶测定方案