图解微流控｜第38期

代谢是生物体与外界物质交换和能量交换的过程，也是活细胞中所有化学变化的总称^[45]。原则上这些化学变化中任一反应物、中间物或产物都可称为代谢物（metabolite），但我们通常提及的代谢物是指代谢终产物，一般都是分子量小于1000的小分子化合物。代谢物分析能够帮助人们更好的理解病变过程及机体内物质的代谢途径，还有助于疾病相关生物标记物的发现，药物的作用机制和毒副作用的研究，对疾病诊断，药物开发和临床用药都具有重要的指导意义。

12.3.1代谢物的一般分析方法

代谢物既然一般都是分子量小于1000的小分子化合物，它的分析与核酸、蛋白等大分子物质的分析理应在方法上有很大的差异，另一方面，由于代谢物存在的生物基质的复杂性，它又不同于一般小分子化合物。很多代谢物在体液中是微量存在的，而很多微量代谢物浓度的细微变化都可能影响机体的正常功能，同时体液中又存在着大量的细胞、蛋白、脂质、无机盐等等物质，这些物质均可能干扰目标代谢物的分离分析。如此复杂的体系决定了代谢物分析方法必须具备以下特点：1，强大的样品预处理能力；2，高效的分离方法；3，高灵敏度的检测手段。

代谢物种类繁多，所采用的分析方法也千差万别，其中尤以活体实时分析和体外离线分析更引起关注。

12.3.1.1活体实时分析

活体实时分析是通过采样器直接采样分析体内代谢物水平。微透析技术是代谢物分析中最重要的活体采样和样品预处理技术。该技术利用待测物在半透膜两端的浓度差异，通过弥散、渗透及过滤等作用，使膜对不同大小的分子选择性截留^{[46, 47]}。即当体液流经透析膜时，其中的代谢物小分子由于体积小能透过半透膜，而细胞和生物大分子则被截留下来，从而消除生物大分子对小分子的干扰。微透析系统包括取样用的微透析探针，微量注射泵和灌注液收集器。微透析采样系统也可直接与分离监测系统如HPLC，HPCE 连接，实现活体采样实时分析，见图12-13。活体实时分析在需要连续监测体内代谢物水平如连续血糖监测和药物代谢动力学研究中被经常采用。

12.3.1.2体外离线分析

体外离线分析是指采样后集中分析代谢物，这也是代谢物分析中最常采用的方法。相对于活体实时分析，它能提供更加全面的代谢物分析结果，尤其在早期高通量药物筛选研究中，体外药物代谢和代谢物分析更是药物代谢研究的重要方式。肝脏是生理和病理状态下药物代谢的重要器官，通过肝脏代谢后，许多内源性和外源性的物质对生物体的毒性作用被消除。作为这个生物转化过程的重要发生器官，肝脏就必然成为药物研究中的重要靶器官。研究中常采用一系列体外的方法研究药物的代谢情况，代谢机制及药物相互作用，如肝微粒体，原代肝细胞，肝脏灌流，肝组织切片，基因工程细胞模型和纯化酶制剂等。如图12-14所示，研究者在微流控芯片上构建了一个用来模拟体内药物代谢过程的模型^[49]，即在芯片上培养鼠肺细胞（L2细胞株）和肝细胞（H4IIE 细胞株）分别模拟肺和肝器官的药物代谢功能，同时模拟脂肪和其他组织的功能，试图在芯片上模拟生理条件下体内药物代谢。研究者以萘酚为对象，整体考察了芯片的性能，结果显示该芯片能相对完整地完成萘酚的代谢过程，表明微流控芯片是一种潜在重要的体外药物代谢研究平台。尽管目前看来，体外药物代谢研究仍然无法完全替代活体药物代谢研究，但由于其具有通量高的特点，在早期药物筛选过程中仍然是重要的研究手段。

12.3.2代谢物的分析应用

通常的代谢物分析主要有两类应用， 一类是通过比较正常和病变生理状态下的重要代谢物（疾病标志物）水平，达到疾病诊断的目的；另一类是通过监测外源性药物代谢物的水平，研究药物代谢及相关药理和毒理学数据，达到指导药物开发和合理临床用药的目的。

12.3.2.1 疾病标志物

生物体液中的代谢物与细胞和组织中的代谢物处于动态平衡。所有的由于病理生理紊乱或外源性的药物或毒物刺激引起的直接生化反应，以及与控制代谢的酶或核酸产生相互作用而引起体内物质在比例、浓度等方面发生的变化，最终都会在代谢物中得到反映。对这些由疾病引起的代谢物的响应进行分析，能够帮助人们更好的理解病变过程及机体内物质的代谢途径，还有助于疾病的生物标记物的发现和辅助临床诊断的目的。下面拟以常见的代谢物为例，介绍微流控芯片在疾病标志物分析方面的应用。

葡萄糖

体液中葡萄糖浓度与多种疾病相关，是代谢物检测的重要指标。尤其对于糖尿病患者，需长期控制饮食和注射胰岛素来维持正常的血糖水平。频繁的血糖测定和胰岛素注射对患者而言，无疑在精神和肉体上都带来巨大的伤害。研究者新近建立的自动血糖测定和胰岛素注射集成微流控芯片系统（GSII）为这一问题的解决提供了一种解决方案^[50]，见图12-15。该微系统模拟人工胰腺，能实时准确监测血糖的水平，如果血糖浓度过高，系统会自动控制微泵和微阀注射准确定量的胰岛素。集成的血糖传感器采用电化学测定血糖的方法。该微系统采血量小，能最大限度地减少病患的痛苦，有可能会发展成一种常规的糖尿病治疗手段。

肾病标志物

尿液中的肌氨酸苷（creatinine）、肌氨酸（creatine）、尿酸（uric acid）和对-氨基马尿酸（p-aminohippuric acid）的含量水平是衡量肾和肌肉功能的重要因素，都是重要的肾病标志物，快速准确测定系列肾病标志物一直是临床化学研究的热点。近来，研究人员在微流控芯片上建立了一种同时检测尿液中肾病标志物的方法^[51]，该方法集成了系列肾病标志物分析所需的酶反应，包括肌氨酸苷酶（CA），肌氨酸酶（CI）和肌氨酸氧化酶（SOx）等反应和电泳分离操作，待检测物质被转化为电活性物质而实现柱端电化学检测。如图12-16所示，肌氨酸苷和肌氨酸被系列酶反应转化成过氧化氢实现检测，要实现肌氨酸苷和肌氨酸的分别测定，可通过对比肌氨酸苷酶（CA）加入前后的结果获得。尿酸和对-氨基马尿酸则可直接通过电化学检测。该方法被应用于尿样中系列肾病标志物的快速测定。

12.3.2.2 外源性药物代谢物

药物代谢物是指药物经药物代谢酶生物转化所得的产物。药物经代谢后，其理化性质将发生变化，从而可能引起其药理和毒理活性的改变，因此，研究药物代谢物，明确其代谢途径及可能带来的毒副作用，对制定合理的临床用药方案、剂型设计及新药开发工作都具有重要的指导意义。微流控芯片技术已经开始被应用于药物代谢物研究，在代谢物检测，高通量药物细胞毒性评价等方面都显示出了其集成化，高通量的优势。

抗抑郁药物

质谱是药物代谢物研究的重要工具，它同时能提供药物代谢物的浓度和结构信息，微流控芯片能方便地实现与质谱的接口，尤其是电喷雾质谱。研究人员在微流控芯片上实现了药物与人肝微粒体的孵化，转化产物脱盐之后经电喷雾接口雾化进入质谱，得到代谢物的信息，实现了三种抗抑郁药物阿密曲替林（imipramine）、多虑平（doxepin）和丙咪嗪（amitriptyline）的微流控芯片代谢，见图12-17。较之传统药物代谢反应，微流控芯片药物代谢酶的消耗量大大降低，结合固定化药物代谢酶技术，肝酶还可反复使用。因此微流控芯片是高通量药物代谢物分析的重要技术平台。

对乙酰氨基酚

对乙酰氨基酚（acetaminophen）俗称扑热息痛是一种广泛使用的解热镇痛临床常见药物，从1966年，Davidson和Eastham首先报道了对乙酰氨基酚引起肝坏死的案例之后，它的肝毒性引起了广泛的关注，对乙酰氨基酚引起肝毒性的一种可能性是过量服用，另一种可能性是由于多种药物的不合理同时服用，影响了乙酰氨基酚的正常代谢，这样即使在治疗剂量之内也会导致严重的肝毒性，此时其它药物与对乙酰氨基酚发生了药物相互作用，增加了其毒副作用。葡醛酸转移酶UGT（UDP-glucuronosyltransferase）通路是对乙酰氨基酚重要的脱毒代谢通路，对乙酰氨基酚的UGT代谢如果被抑制，势必会增加其转化为醌亚胺（NAPQI）活性中间代谢物的几率^{[53, 54]}。

作者所在的课题组采用一种三层立体结构芯片来研究对乙酰氨基酚代谢（图12-18）^[55]，芯片结构如图12-19所示，芯片上层为PDMS盖片，中间层为刻蚀有微液流通道和采用SOL-GEL技术固定化有肝微粒体的微通孔阵列的石英芯片，下层为刻蚀有微液流通道和使细胞均匀分布的微结构的PDMS芯片。药物从上层与中间层形成的微通道中引入，在SOL-GEL固定化肝微粒体区域发生代谢反应，一方面SOL-GEL是药物代谢微反应器，同时它也将药物代谢物检测和细胞毒效应评价分隔在不同的层完成。细胞从下层通道中引入，固定化的SOL-GEL阻止其进入上层通道。这样，药物经固定化肝微粒体代谢，部分被加电引入分离通道，在紫外吸收检测微流控芯片平台上完成电泳分离检测，同时，药物代谢物通过扩散与均匀分布在SOL-GEL底部区域的细胞作用，由于采用的SOL-GEL具有光通透性，因此在荧光显微镜上来获取药物作用后的细胞存活率，籍此来判断药物代谢物的细胞毒性。

实验中，对乙酰氨基酚（AP）在富含与肝微粒体中的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）催化作用下，与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸 （UDPGA）发生代谢反应，一部分代谢产物进入分离检测通道，进而得到紫外吸收图谱；同时代谢产物进入细胞培养层与HEPG2细胞作用，在荧光显微镜下通过染料标记死活细胞数来确定细胞的存活率。最终得到药物空白、药物代谢空白和药物代谢三组数据，通过三组数据对比便可准确地获取药物代谢物的分子结构信息和代谢对药物细胞毒性的影响，见图12-20。   

文章来源：《图解微流控芯片实验室》林炳承、秦建华 著